Para combater o efeito de qualquer novo vírus, é importante entender o mecanismo pelo qual ele infecta as células do hospedeiro, supera o mecanismo de defesa imune do hospedeiro e aumenta a síntese e a replicação das proteínas virais.
Fundo
A abordagem preventiva mais proeminente para minimizar o efeito da infecção por síndrome respiratória aguda grave por coronavírus 2 (SARS-CoV-2) em células hospedeiras tem sido até agora o desenvolvimento de vacinas. Essas vacinas têm como alvo a proteína de pico viral responsável pela ligação às células hospedeiras e entrar na circulação sistêmica.
No entanto, a vacinação não interrompe completamente a propagação da doença. Como o SARS-CoV-2 é um vírus novo, é inevitável que ele passe por várias rodadas de mutações que produzem novas variantes que podem ser resistentes às vacinas existentes.
Isso destaca a necessidade do desenvolvimento de medicamentos que visam a maquinaria central do SARS-CoV-2 e podem ser usados ??para tratar indivíduos infectados. Para tanto, a proteína não estrutural 1 (NSP1) parece ser uma candidata ideal como alvo. Pesquisas anteriores mostraram que o NSP1 é uma região conservada em todos os beta- coronavírus , a família à qual o SARS-CoV-2 pertence.
No entanto, relatos anteriores na literatura sobre os métodos pelos quais NSP-1 invade o sistema hospedeiro interrompem a síntese de proteínas específicas do hospedeiro e induzem a síntese de proteínas virais permanecem contraditórios. Em um estudo recente publicado no servidor de pré-impressão, bioRxiv * , os pesquisadores tentam resolver essa confusão estudando os aspectos moleculares da entrada na célula hospedeira e da inibição de mecanismos celulares específicos do hospedeiro.
O que é NSP1?
O NSP1 é um fator de virulência importante que desempenha um papel crucial na patogenicidade do SARS-CoV-2, ajudando o vírus a escapar da resposta imune inata do hospedeiro. O NSP1 regula negativamente a expressão dos genes do hospedeiro e promove sua própria propagação ao neutralizar as respostas antivirais das células hospedeiras às quais o vírus se liga.
O genoma do SARS-CoV-2 é um vírus de ácido ribonucléico (RNA) de fita positiva de aproximadamente 30 quilobases (kb) com estrutura de capa 5 ‘, 5’UTR (ou líder), 3’UTR e cauda poliA. O SARS-CoV-2 contém 10 estruturas de leitura aberta de codificação de proteína (ORFs), que são partes do genoma onde a tradução da proteína pode ocorrer sem encontrar quaisquer códons de parada.
Após a entrada na célula, o RNA genômico (gRNA) é traduzido em poliproteína, que é processada em 16 proteínas não estruturais (NSPs). Posteriormente, seu gRNA serve como molde para gerar um conjunto de mRNAs subgenômicos (sgRNAs) que codificam outras proteínas virais.
A primeira proteína produzida por coronavírus após a infecção é a NSP1, que é codificada por ORF1a na extremidade 5 ‘do gRNA. Em estudos anteriores sobre o relacionado SARS-CoV-1, NSP1 foi encontrado para inibir as respostas imunes do hospedeiro, reprimindo a expressão de transcritos do hospedeiro e evitando a indução completa de interferon (IFN) e fosforilação de STAT1, ambos os quais são cruciais para a iniciação do antiviral respostas imunológicas.
Sobre o estudo
No estudo atual, os pesquisadores avaliaram o potencial do NSP1 como um alvo, estudando os mecanismos moleculares detalhados de suas funções. Para tanto, eles sintetizaram o genoma viral por meio da clonagem de sequências conhecidas do SARS-CoV-1 e 2 e da separação de proteínas específicas por meio de técnicas de Western Blotting.
Os pesquisadores usaram a mutagênese para detectar o efeito de diferentes mutações em genes específicos para avaliar seus papéis na evasão imunológica por SARS-CoV-2 NSP1. Os ensaios de repórter também foram utilizados para detectar mudanças específicas como resultado das mutações induzidas. A espectroscopia de massa foi usada para analisar as proteínas.
Ensaios específicos baseados em biotina (BioID) foram usados ??para localizar proteínas de interesse e estudar as diferentes proteínas nas partes funcionais da proteína SARS-CoV-2 NSP1. Este ensaio ajudou os pesquisadores a compreender as diferentes partes da proteína NSP1 envolvidas em diferentes mecanismos de defesa antiviral. Para todos esses experimentos, os pesquisadores usaram células humanas HEK293T como hospedeiros.
Resultados do estudo
Os pesquisadores do estudo atual descobriram que o stem loop-1 (SL1), que é uma estrutura em grampo no RNA de fita simples que ajuda o mRNA viral a reter sua estrutura e continuar interações enzimáticas específicas, é necessário e suficiente para escapar do NSP1 mediado repressão. A mutagênese foi usada para isolar 3 proteínas específicas da citosina, que é uma das quatro bases de ácido nucléico do RNA, que foram cruciais para a evasão dos mecanismos de defesa do hospedeiro.
Após análise adicional da proteína por BioID, NSP1 foi encontrado para bloquear a tradução do hospedeiro, inserindo seu domínio C-terminal no túnel de entrada de mRNA na subunidade 40S ribossomal. Ao fazer isso, o NSP1 bloqueou a síntese ribossômica da proteína hospedeira e exportou os mRNAs virais para o sistema. Um KH164AANSP1 mutante não funcional construído artificialmente não poderia replicar o mecanismo do NSP1 de tipo selvagem de forma tão eficaz.
Normalmente, quando um vírus ataca as células hospedeiras, o RNA viral é detectado por helicases de RNA hospedeiro em células infectadas, resultando na ativação dos fatores de transcrição ATF2 / c-Jun, IRF3 / IRF7 e NF-kB. Esses fatores subsequentemente induzem a produção de citocinas, incluindo membros da família IFN, que passam a se ligar a seus respectivos receptores e disparam uma segunda onda de sinalização de citocinas. Essas duas ondas regulam positivamente os genes que inibem a replicação viral.
Em última análise, descobriu-se que o NSP-1 evita essas vias para evitar a indução de citocinas, ajudando assim o vírus a se espalhar no sistema hospedeiro.
Modelo especulativo para a função de NSP1 na repressão do mRNA do hospedeiro e ativação da expressão de SARS-CoV-2. A proteína WT NSP1 reprime a tradução do mRNA do hospedeiro através do bloqueio do túnel de entrada do ribossomo. Os RNAs genômicos e subgenômicos SARS-CoV-2 escapam da repressão por NSP1 devido ao SL1 em ??seu 5?UTR, interagindo com NSP1. Desta forma, o RNA viral alcança os ribossomos do hospedeiro sem competir para limitar os eIFs nas células infectadas. Em particular, as posições C15, C19 e C20 são necessárias para o alívio do silenciamento de NSP1. As posições K164H165 em NSP1 são necessárias para interação com o ribossomo, portanto, o mutante KH164AA de NSP1 não reprime o mRNA do hospedeiro ou SARS-CoV-2. A posição R124 é necessária para a interação com SL1, portanto, o mutante NSP1 R124A reprime tanto o mRNA do hospedeiro quanto o viral.
Implicações
O estudo atual mostrou que o SARS-CoV NSP1 do tipo selvagem foi responsável pela ligação aos ribossomos do hospedeiro e pela indução da produção de mRNA viral. NSP1 também evitou respostas imunes e adiou a liberação de citocinas inflamatórias.
O primeiro alvo terapêutico identificado neste estudo é o local de ligação do NSP1 ao ribossomo do hospedeiro. Um segundo alvo envolveria a indução de mutações na região NSP1 que interage com o líder viral para evitar as respostas antivirais do hospedeiro, e que na região SL-1, tendo como alvo as 3 moléculas de citosina específicas.
Texto retirado de News Medical.
Crédito da imagem: Design_cells / Shutterstock.com