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CRISPR anuncia progresso na terapia genética

Nos últimos dez anos, o revolucionário editor de genes CRISPR mudou a maioria das regras na área de pesquisa genética. Os cientistas têm explorado o alcance dessa ferramenta incrivelmente útil desde então. No outono de 2019, os primeiros ensaios clínicos começaram com o uso do CRISPR para alterar genes que causam câncer, por exemplo. O princípio fundamental dessa terapia é extrair algumas células do sujeito, editar o gene alvo usando o CRISPR e reinserir as células editadas no mesmo indivíduo para permitir que elas combatam a doença. Parece o sonho final de um remédio perfeitamente personalizado, que pode realmente corrigir a doença desde a raiz.

Os problemas com o CRISPR

No entanto, o CRISPR ainda está em um estado relativamente incipiente. Existem problemas de segurança com o uso do CRISPR, incluindo o perigo de editar bits indesejados de DNA ou atingir locais errados, levando aos chamados efeitos genéticos “fora do alvo”.

Outro problema é que os cientistas realmente não dominam a arte de fazer com que a edição do CRISPR faça o que deveria fazer em todas as células. Até agora, apenas cerca de 10% dos experimentos conseguiram obter a edição desejada, conforme a célula visada.

A maioria das edições do CRISPR foi realizada em linhas celulares imortalizadas ou de células cancerígenas, nas quais a edição é mais fácil. No entanto, as células-tronco pluripotentes são muito mais úteis na pesquisa genética, mas são mais difíceis de modificar. Como resultado, os cientistas ainda estão buscando edição de genes mais bem-sucedida e eficiente, especialmente em células-tronco.

Sobre células-tronco

As células-tronco pluripotentes induzidas são células adultas saudáveis ​​que foram induzidas a voltar o relógio do desenvolvimento e perder marcadores de diferenciação (para se tornarem células-tronco), enquanto recuperam a capacidade de se multiplicar. Essas células são células indiferenciadas que têm a capacidade de se desenvolver em qualquer um dos diferentes tipos de células do corpo, mas também podem se multiplicar indefinidamente para manter o pool de células indiferenciadas. Uma vez que uma célula se diferencia em um tipo específico de célula, ela não pode mais mudar sua direção de desenvolvimento e, na maioria dos casos, não pode mais se multiplicar.

O problema que os pesquisadores enfrentam é que, diferentemente das células diferenciadas, as células-tronco não respondem à tecnologia convencional de edição de genes CRISPR, embora as razões ainda não estejam claras. Para superar isso, a equipe da ASU adotou uma modificação nessa técnica, relatada pela primeira vez pelo laboratório de David Liu em Harvard, para editar genes em células-tronco.

O estudo

O estudo atual de David Brafman e seus colegas da Universidade Estadual do Arizona (ASU) está focado em aprender mais sobre doenças como a doença de Alzheimer (DA), resultado da degeneração do sistema nervoso central. A pesquisa está centrada no uso de células-tronco para estudar os efeitos de mutações específicas ou fatores de risco nessa condição.

O presente estudo utiliza um novo método de relatório chamado TREE (Transient Reporter for Editing Enrichment) para modificar o CRISPR, possibilitando assim o enriquecimento de populações de células – e até de células-tronco humanas, pela primeira vez – onde a base de DNA foi editada, em alta eficiência. Toda a diferença entre o CRISPR e a abordagem TREE modificada é que, enquanto o primeiro faz um corte em ambos os filamentos de DNA de uma só vez, o segundo corta apenas um filamento – e relata que o fez. Por exemplo, após alterar uma única base de DNA de citosina para timina, uma proteína sinaliza a mudança mudando de cor de azul para verde.

Assim, o brilho verde significa uma chance maior que 90% de que a célula tenha sido editada com sucesso, permitindo que os pesquisadores selecionem as células editadas com mais eficiência e deixem de fora as outras. As células editadas (verdes) são então cultivadas por elas mesmas, para produzir clones que podem ser cultivados indefinidamente para produzir um pool renovável de células com a edição genética específica necessária.

As vantagens

O processo da doença na DA é complexo, não devido a uma mutação de base única, ao contrário da anemia falciforme ou fibrose cística. Pode haver vários fatores que agem em sincronia para aumentar o risco da doença. Brafman explica a vantagem de usar o TREE nesta situação: “Queríamos uma maneira de introduzir várias edições simultaneamente em células-tronco pluripotentes. Porque, caso contrário, você teria que adotar essa abordagem iterativa sequencial, onde introduzir uma edição, isolar uma população clonal, introduzir outra edição e assim por diante. ”

Para o estudo, a equipe utilizou células-tronco pluripotentes induzidas, derivadas de pacientes saudáveis ​​e com DA, tendo estas últimas esporádicas ou tardias. Essas células representam as células nervosas e outros tipos de células encontrados no cérebro nos pacientes que apresentam esses fatores de risco, uma vez que possuem o mesmo DNA.

O gene APOE foi o alvo do atual experimento de edição de genes para prova de conceito de base única. Esse gene vem em três variantes, uma chamada APOE4, que aumenta o risco de DA de início tardio.

Usando o TREE, os cientistas editaram bases únicas nesse gene e, ao contrário do CRISPR, eles podiam modificar com precisão as duas cópias do gene. Agora, diz Brafman, “podemos entender por que uma variante do APOE pode aumentar ou diminuir o risco e, em seguida, podemos começar a direcionar os caminhos afetados”.

Outra vantagem do TREE é a capacidade de eliminar ou remover genes de importância para o processo da doença. Isso permitirá que os cientistas vejam se o gene (neste caso, APOE4) é bom para a célula, ruim para ela ou não faz uma grande diferença.

“A abordagem tradicional do CRISPR é que você precisa editar uma vez para obter uma edição heterozigótica, depois isolar esse clone, editar novamente para obter outra edição heterozigótica”, segundo Brafman. “Portanto, é muito ineficiente dessa maneira. Estamos gerando edições homozigotas com uma eficiência próxima de 90%. Não vi outras tecnologias que possam fazer isso em células-tronco pluripotentes. ”

As evidências

Os resultados são surpreendentes: os pesquisadores, embora não sejam de um laboratório especializado em edição de genes, conseguiram editar bases únicas na cadeia de DNA com extrema precisão e até 90% de eficiência, usando células-tronco humanas.

Antigamente, os cientistas não tinham ideia se as edições desejadas haviam sido feitas porque as células não mostravam nenhuma diferença. Em vez de fazer o que Brafman chama de “um palpite aleatório”, cutucando o CRISPR nas células e esperando obter os resultados certos, com precisão de 10% a 15%, eles são capazes de selecionar as células editadas e, basicamente, seguir adiante apenas com essas células.

Pesquisas anteriores desta equipe mostraram o potencial da abordagem TREE na edição de genes de células humanas. O impulso atual foi aperfeiçoá-lo ainda mais para obter uma edição rápida e eficiente de células-tronco humanas.

Eles conseguiram usar a TREE para gerar populações de células-tronco nas quais vários genes foram editados simultaneamente. Mais de 80% das células apresentaram edições bem-sucedidas nos três locais de destino e, em todos esses casos, as edições foram feitas nos dois fios. Em outras palavras, uma abordagem multiplex permitiu-lhes alcançar a mesma alta eficiência que fazer edições seqüenciais uma a uma, enquanto obtinha um pool de células in vitro nas quais o processo da doença pode ser estudado e os medicamentos podem ser testados.

Conclusão

Brafman diz: “Queremos continuar expandindo essa caixa de ferramentas. Já obtivemos um alto nível de interesse de outros cientistas que o usarão para gerar suas próprias linhas de células. Prevemos que esse método terá implicações importantes para o uso de linhas de células-tronco humanas em aplicações de biologia do desenvolvimento, modelagem de doenças, triagem de medicamentos e engenharia de tecidos. ”

 

Texto retirado de News Medical.

Crédito de imagem: Meletios Verras / Shutterstock

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